Prinsipyo ng Eksperimento
Ang Hemoglobin electrophoresis ay naglalayong tuklasin at kumpirmahin ang iba't ibang normal at abnormal na hemoglobin.
Dahil sa iba't ibang mga singil at isoelectric point ng iba't ibang uri ng hemoglobin, sa isang tiyak na pH buffer solution, kapag ang isoelectric point ng hemoglobin ay mas mababa kaysa sa pH ng buffer solution, ang hemoglobin ay nagdadala ng negatibong singil at lumilipat patungo sa anode sa panahon ng electrophoresis. Sa kabaligtaran, ang hemoglobin na may positibong singil ay gumagalaw patungo sa katod.
Sa ilalim ng isang tiyak na boltahe at pagkatapos ng isang tiyak na oras ng electrophoresis, ang mga hemoglobin na may iba't ibang mga singil at molecular weight ay nagpapakita ng iba't ibang direksyon at bilis ng paglipat. Ito ay nagbibigay-daan para sa paghihiwalay ng mga natatanging zone, at ang kasunod na colorimetric o electrophoretic scanning analysis ay maaaring isagawa sa mga zone na ito upang mabilang ang iba't ibang hemoglobin. Ang pinakakaraniwang ginagamit na paraan ay pH 8.6 cellulose acetate membrane electrophoresis.
Sa loob ng cytoplasm, ang mga ethylene glycol group (CHOH-CHOH) na nasa glycogen o polysaccharide substances (tulad ng mucopolysaccharides, mucoproteins, glycoproteins, glycolipids, atbp.) ay na-oxidize ng periodic acid at na-convert sa aldehyde group (CHO-CHO). Ang mga grupong ito ng aldehyde ay pinagsama sa walang kulay na purplish-red Schiff reagent, na bumubuo ng isang purple-red dye na nagdedeposito kung saan naroroon ang mga polysaccharides sa cell. Ang reaksyong ito ay kilala bilang periodic acid-Schiff (PAS) staining, na dating tinutukoy bilang glycogen staining.
Paraan ng Eksperimento
Mga materyales:Cellulose acetatemembrane, electrophoresis apparatus(DYCP-38C at power supply DYY-6C ), Superior Sample Loading Tool(pipette), spectrophotometer, colorimetric cuvettes, mga buffer.
Buffer:
(1) pH 8.6 TEB Buffer: Timbangin ang 10.29 g Tris, 0.6 g EDTA, 3.2 g boric acid, at magdagdag ng distilled water sa 1000 ml.
(2) Borate Buffer: Timbangin ang 6.87 g borax at 5.56 g boric acid, at magdagdag ng distilled water sa 1000 ml.
Pamamaraan:
Preparasyon ng Hemoglobin Solution
Kumuha ng 3 ml ng dugo na naglalaman ng heparin o sodium citrate bilang isang anticoagulant. Centrifuge sa 2000 rpm sa loob ng 10 minuto at itapon ang plasma. Hugasan ang mga pulang selula ng dugo ng tatlong beses gamit ang physiological saline (750 rpm, 5 minutong sentripugasyon bawat oras). Centrifuge sa 2200 rpm sa loob ng 10 minuto at itapon ang supernatant. Magdagdag ng pantay na dami ng distilled water, pagkatapos ay magdagdag ng 0.5 beses ang dami ng carbon tetrachloride. Kalugin nang malakas sa loob ng 5 minuto, at pagkatapos ay i-centrifuge sa 2200 rpm sa loob ng 10 minuto upang makolekta ang itaas na solusyon sa Hb para magamit sa ibang pagkakataon.
Pagbabad sa Lamad
Gupitin ang cellulose acetate membrane sa mga piraso na may sukat na 3 cm × 8 cm. Ibabad ang mga ito sa pH 8.6 TEB buffer hanggang sa ganap na mabusog, pagkatapos ay tanggalin at i-blotter gamit ang filter na papel.
Spotting
Gumamit ng pipette upang makita ang 10 μl ng hemoglobin solution nang patayo sa cellulose acetate membrane (ang magaspang na bahagi), mga 1.5 cm mula sa gilid.
Electrophoresis
Ibuhos ang borate buffer solution sa electrophoresis chamber. Ilagay ang cellulose acetate membrane na may batik-batik na gilid sa dulo ng katod ng kamara. Patakbuhin sa 200 V sa loob ng 30 minuto.
Elution
Gupitin ang HbA at HbA2 zone, ilagay ang mga ito sa magkahiwalay na test tubes, at magdagdag ng 15 ml at 3 ml ng distilled water, ayon sa pagkakabanggit. Dahan-dahang iling upang lubusang maalis ang hemoglobin, pagkatapos ay ihalo.
Colorimetry
I-zero ang absorbance gamit ang distilled water para sa elution solution at sukatin ang absorbance sa 415 nm.
Pagkalkula
HbA2(%) = Absorbance ng HbA2 tube / (Absorbance ng HbA tube × 5 + Absorbance ng HbA2 tube) × 100%
Pagkalkula ng mga Eksperimental na Resulta
Reference Range para sa pH 8.6 TEB Buffer Cellulose Acetate Electrophoresis: HbA > 95%, HbA2 1%-3.1%
Mga Tala
Ang oras ng electrophoresis ay hindi dapat masyadong mahaba. Ang cellulose acetate membrane ay hindi dapat matuyo sa panahon ng electrophoresis. Itigil ang electrophoresis kapag malinaw na hiwalay ang HbA at HbA2. Ang matagal na electrophoresis ay maaaring magdulot ng band diffusion at blurring.
Iwasang gumamit ng masyadong maraming sample. Ang labis na likidong hemoglobin ay maaaring humantong sa pag-detachment ng banda o hindi sapat na paglamlam, na nagreresulta sa maling pagtaas ng mga antas ng HbA.
Pigilan ang kontaminasyon ng cellulose acetate membrane na may mga protina.
Ang agos ay hindi dapat masyadong mataas; kung hindi, ang mga banda ng hemoglobin ay maaaring hindi maghiwalay.
Palaging isama ang mga specimen mula sa mga normal na indibidwal at mga kinakailangang kilalang abnormal na hemoglobin bilang mga kontrol.
Ang Beijing Liuyi Biotechnology ay gumagawa ng propesyonal na tangke ng electrophoresis para sa hemoglobin electrophoresis na siyang modeloDYCP-38Ccellulose acetate membrane electrophoresis tank, at mayroong dalawang modelo ng electrophoresis power supply na magagamit para sa cellulose acetate membrane electrophoresis tankDYY-2CatDYY-6Csuplay ng kuryente.
Samantala, ang Beijing Liuyi Biotechnology ay nagbibigay ng cellulose acetate membrane para sa mga customer, at ang laki ng cellulose acetate membrane ay maaaring ipasadya. Maligayang pagdating upang humingi sa amin ng mga sample at higit pang impormasyon.
Ang tatak ng Beijing Liuyi ay may higit sa 50 taong kasaysayan sa China at ang kumpanya ay maaaring magbigay ng matatag at mataas na kalidad na mga produkto sa buong mundo. Sa pamamagitan ng mga taon ng pag-unlad, ito ay karapat-dapat sa iyong pinili!
Naghahanap kami ngayon ng mga kasosyo, parehong OEM electrophoresis tank at mga distributor ay tinatanggap.
Kung mayroon kang anumang plano sa pagbili para sa aming mga produkto, mangyaring huwag mag-atubiling makipag-ugnayan sa amin. Maaari kang magpadala sa amin ng mensahe sa email[email protected]o[email protected], o mangyaring tawagan kami sa +86 15810650221 o idagdag ang Whatsapp +86 15810650221, o Wechat: 15810650221
Oras ng post: Set-20-2023